酰胺类化合物是天然生物活性分子和有机合成中重要的中间体，广泛应用于工业、农业及医药等领域。腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase)是一类能够催化腈类化合物中氰基水合反应生成相应酰胺类化合物的金属酶。NHase的发现开启了温和条件下利用腈类化合物绿色合成酰胺类化合物的新纪元。由于自然来源的腈水合酶菌株均存在筛选周期长、培养条件苛刻、蛋白表达能力差等缺陷，腈水合酶在大肠杆菌等基因工程菌中异源表达已经成为了腈水合酶高效表达和工程化改造的有效手段。

梁长海教授团队在前期研究中发现了一种来源于Rhodococcus erythropolis CCM2595的Fe型腈水合酶（ReNHase），并构建了表达ReNHase的工程菌株。底物谱实验结果发现该酶对二腈类化合物具有优异的完全转化率和区域选择性（ACS Omega, 5(2020) 18397–18402，Patent: US11421214B2）；后续进一步发现ReNHase在异源表达的过程中存在大量不溶性包涵体导致酶活性较低，以及相邻亚基表达水平失衡而造成的正确折叠组装的ReNHase数量大幅降低的问题。

基于上述问题，梁长海教授团队首先采取了引入融合标签促溶的策略，发现融合标签的引入会对ReNHase结构和活性造成影响。进而采取了核糖体结合位点（Ribosome-binding site，简称RBS）优化策略，通过引入来源于Bacillus subtilis的高效启动蛋白表达的RBS序列实现了β亚基的高效表达。经优化后的ReNHase不仅实现了α/β亚基间的平衡表达，且比酶活提高了12倍，达到了3679U/mg。酶动力学表征结果显示催化效率常数Kcat/Km提高了3.75倍。对优化后的RBS进行mRNA二级结构分析发现，RBS与附近序列对应的mRNA形成了更大的“环状”结构，且最低折叠自由能明显提升，表明RBS优化后转录的mRNA自折叠形成的茎环结构不稳定，更容易解聚并结合核糖体启动β亚基的合成。

近日相关结果以《Significant Enhancement Catalytic Activity of Nitrile Hydratase by Balancing the Subunits Expression》为题发表在ChemBioChem上。论文第一作者为bwin必赢博士研究生郭祎，通讯作者为bwin必赢梁长海教授与盘锦校区化工海洋与生命学院王黎副教授。相关研究也获得国家发明专利授权（《一种提高腈类化合物生物转化效率的腈水合酶重组质粒及其构建方法与应用》，ZL 202310433598.2）。上述工作得到辽宁省“兴辽英才计划”(XLYC1908033)、中央高校基本科研业务费专项基金(DUT2021TD103, DUT23YG121)以及大连理工大学成都研究院的资助。文章链接：https://doi.org/10.1002/cbic.202400526